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皮質醇ELISA試劑盒定量檢測方法-上海仁捷生物

發布時間:2017-06-30   點擊次數:2038次

皮質醇ELISA試劑盒常見的定量方法

測定原理:現在皮質醇ELISA試劑盒除非是測定抗體的以外,一般使用的是雙抗體夾心法,此種方法大多數用的是增強的雙抗體夾心法,即使用生物素-親和素系統,還有少數的指標可能使用競爭法,這類方法適用于半抗原的測定。

具有復雜結構的多表位蛋白抗原,其雙抗體夾心法中的一個抗體必須用單抗,否則背景很高。當然如果兩個都是單抗(這兩個單抗針對不同表位),那么測定的線性范圍就較寬,試劑盒性能就較好;一個用單抗,一個用多抗,測定的靈敏度會較高。

某些簡單的化合物用皮質醇ELISA試劑盒測定時,因為沒有兩個或以上的表位,一般只能作為半抗原,只能用競爭法測定。如果你發現有測定簡單化合物(如雌激素、NO、地高辛等)用雙抗體夾心法作測定原理時,這個試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區別。

一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形,隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后,測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色,即所謂的“鉤狀效應”(hookeHect),也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現象”(zonephenomenon)。所以當使用一步雙抗體夾心法時,樣品濃度太高,有時會出現測不出來的現象,此時要作適當的稀釋才能準確測定。

皮質醇ELISA試劑盒的組成:用雙抗體夾心法作為測定的方法時,試劑盒的組成一般包括:已包被單抗的酶標板:一塊,有96孔的,也有48孔的,可拆缷,外面有鋁箔袋密封,打開后有干燥劑,實驗時暫未使用的酶標條要連帶干燥劑密封好,放在4℃冰箱中妥善保存。

皮質醇ELISA試劑盒操作步驟

1、準備:從冰箱取出試劑盒,室溫復溫平衡30分鐘。

2、配液:用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標準品和待測樣本:取足夠數量的酶標包被板,固定于框架上,分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔,記錄各孔位置,在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加。

4、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5、洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

6、加酶標工作液:每孔加入酶標工作液50μL,空白對照孔不加。

7、溫育:重復4的操作。

8、洗板:重復5的操作。

9、顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL,再加入顯色劑B液 50μL,37℃避光顯色15min。

10、終止:取出酶標板,每孔加終止液50μL,終止反應(顏色由藍色立轉黃色)。

11、測定:以空白孔調零,在終止后15分鐘內,用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。

12、計算:根據標準品的濃度及對應的OD值,計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據樣本的OD值,在回歸方程上計算出對應的樣品濃度,也可以使用各種應用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。

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